“我开始用了3克吴茱萸，患者服用后没有效果，增加到9克还是没有效果，又加到50克还是没效果。”这位老中医说，他从来没有遇到这种情况，然后让患者把药拿来一看，结果是假的。假的怎么会有效，不吃出毛病来就不错了。”这是一位老中医遭遇假药后的感叹。
很多老中医抱怨，同样的方子，几十年前，一般一次开三副，如果对证三副就起效，有的甚至一副药下去，病就好了，现在，大多一次开七副，即使对证效果也不甚明显。原因就在于，过去的中草药大多都是野生的，大面积种植的速生药材效果是无法和野生药材相比的。
中草药以假乱真、以次充好，以及大面积速生种植，已经使中草药彻底失去了本真和“元气”。
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中草药造假登峰造极
过去的龙骨很便宜，如今价格飙升，主要是因为不可再生的资源越来越少。所以，很多药店的龙骨都是假的。有的龙骨直接打成粉末，不要说患者，就是具备一定专业知识的人也无法鉴别真伪。有的造假者用石灰和矿物粉制成骨头模型，煅烧成型后，打碎，充龙骨卖。龙齿和龙骨一样，也是“龙”的一部分，假货有多少，安徽亳州药材市场的供货商心里最清楚。
在北京南三环刘家窑附近一家药店连锁店出售的桃仁用的是杏仁。杏仁是心状的，桃仁是扁平椭圆形的，没有杏仁饱满且干瘪。桃仁是活血化瘀的，常被用于女科疾病，作用是活血化瘀；而杏仁大家都知道是治疗咳嗽的，作用是止咳化痰润肠。如果女患者要用桃仁治疗瘀血造成的月经不调、闭经，给人家用杏仁，作为药剂师如果不懂，那你这个药剂师就是用人单位失察和自身的失职；如果明知道是杏仁因价格比桃仁便宜，而故意当桃仁使用，那良心真是坏透了，这对患者就是一种侮辱。
中药材市场究竟有多少假药、次药，没有人详细调查统计过。
元胡像山药蛋，粒状的掺假少，容易鉴别。掺假的多是掺了大小差不多的砂石。元胡片药材，掺假就多了，多为山药蛋切成两半后，加工后掺入，如果用于止痛，那不是误事吗？
沉香进价每公斤30-50元，医药公司卖400-500元，贵就贵吧，是真的倒也无所谓。而假的则用枯木喷上沉香油冒充。这伎俩和酒店一滴香制造高汤是一个路途。
不少人都知道茯苓，说是能减肥，连超市都有不懂药的妇女在打粉出售，忽悠消费者。可曾知道，你买的茯苓是造假者用米粉加工后切片而成的。茯苓“孪生兄弟”茯神，又名“抱松根”，现在的茯神，中央的松根很少，外边的茯苓很大一块，好像你吃芝麻饼，一个烧饼上只有一粒芝麻，也称为芝麻饼。有的松根还是新鲜的，一看就是人为造假。真货应当松根快腐烂了才对。如果用这种“茯神”安神治失眠，不做美国梦才怪。
威灵仙是治疗腰腿痛的良药，威力大得像神仙一样。有老中医说，目前市面上八成都是根系发软的假货。
大家夏天都爱喝酸梅汤，酸梅汤里制造商放了几个乌梅，或者是怎样用添加剂勾兑的，不清楚。不过，作为药材用的乌梅，纯真的货很少。对造假者来说，弄成“乌”色简直太简单了。你配药的乌梅很有可能是野桃醋泡后晒干的冒充品。“乌梅丸”是张仲景的一张很厉害的方子，运用了千年，疗效可是刚刚的。如果老中医信心满满给你开了乌梅丸加味，没有效果，那你就不要埋怨老中医，去骂造假者好了。
目前市面上90%的枳实都是青皮，这样枳实白术散的疗效，就大打折扣了。笔者用小承气汤之后，居然肠道没有反应，后来一看大黄是土地黄，枳实大概就是青皮吧，不然怎么会没效果呢？
掺假者用苏子代替菟丝子。造假者将未成熟的野生葡萄（产量很大），晒干后染色充北五味子。如果老中医给你开了生脉饮，用的五味子是葡萄籽，那就糟了。
像黑炭一样的熟地，是一种常用滋补药，著名的六味地黄丸里就有熟地。你将熟地放在口中嚼嚼，试试掺了多少泥砂。
还有一种“造假”手段，药是真的，其实“内脏”早已被挖空，比如肉桂，也就是制作五香调料用的桂皮，外表没什么两样，而油已经被制药厂提取了。黄连素是治疗拉肚子的药，主要成分是从川黄连中提取的，提取后的黄连，用手一扭就成了渣子。这种被“破身”的药因为价格便宜，药店很乐意进货，因为照样可以当好药卖。有药商把厂家三七提取三七皂甙后的“药渣”晒干，就成了冒牌三七，这种三七质地较碎，断面呈白色，含量很低，效果很差。常用药川芎是用制药厂已提取过有效成分的川芎片冒充。
炮山甲（又称甲珠）一克要十几块钱，但是掺盐或加重粉（硫酸镁）的很多。实验证明，将200克甲珠水泡洗后晒干，只剩下110克，也就是说掺了45%的盐和加重粉。你还敢给哺乳期妇女通乳吗？
白附片，掺假者用红薯或土豆加工成形状相似的片形，晒干熏漂而成。通草掺假者多用明矾、加重粉，质地干硬，味道有的涩、有的无味，有的掺假者将通草切成小段或碎段，掺在正品中卖。
近几年，阿胶价格暴增，不少女人用来补血。到底有多少人吃的是真阿胶呢？阿胶放沸水中溶解，溶液呈棕红色，较澄明，下层无沉淀，清而不浊。伪品猪皮、狗皮、马皮溶解后胶水溶液呈棕褐色，下沉大片胶丝结片及黑渣。你吃的阿胶是这样的呢？还是不如这样的呢？除非毛驴像猪那样多，否则想吃到真阿胶，只能凭运气和感觉。再说了驴皮做的真阿胶供应特殊人物都不够，还轮到你了吗？
胎盘是用玉米面加鸡肠子做的，没想到吧。不要说九节菖蒲，就是普通石菖蒲，市面上也少得很，大部分都是水菖蒲代替，本来是醒神开窍的，用了水菖蒲不就变得更是沉睡不醒了吗？西洋参有的是药商已经浸泡萃取之后再烘烤晒干的，用包装豪华一下，你能辨别出来吗？眼镜利润高，这比贩毒还赚钱。药材造假的道道不是一般的“道”，黑得很。
药材市场上有多少假药，药检人员也不知道。这里只能选择几种常用药普及一下知识，而更多的恐怕学中药的博士也未必不走眼。
2
药材炮制的随意与龌龊
创建于清康熙八年(1669年)的北京同仁堂药店，有这样一副对联：“炮制虽繁必不敢省人工，品味虽贵必不敢减物力。”大概意思是，为了保证药材的特别疗效，炮制过程虽然繁琐也不敢投机取巧，随意而为，药材虽然贵重也不敢缺斤短两，以次充好。
有些中药材要经过炮制之后，才能发挥其特殊的疗效。一般炮制方法分炒、土炒、麸炒、醋炒、酒炒、蜜炙、钒制、姜制、蒸、锻、煨等，古代老草医使用的草药就是用这些方法炮制出来的。想当年的同仁堂、胡庆余堂、达仁堂等百年老字号药店的老药工想必就是像对联所描述的那样一丝不苟。正是因为老药工炮制工艺的娴熟与精湛，才使老字号药店成为老字号。
现在的药店，炮制的中药越来越少，这与懂得中药炮制工艺的老药工极为罕见，以及炮制工艺的失传有很大的关系。即使所谓的炮制也是删繁就简，随意随便。炮制工艺中有九蒸九晒一项，比如黄精、熟地经过这样炮制之后，其效果才是最好的。有位老中医说，你能找到一家店是把熟地做了九次蒸九次晒的吗？所谓标榜的“九蒸九晒”只不过是哄人而已。也是，小作坊都能用添加剂捣鼓出以假乱真的名酒来，“九蒸九晒”算个啥？如此复杂费力的炮制方法，在急功近利只顾赚钱的当下，不过是个神话。想想看，连珍珠母、生石膏、生牡蛎、代赭石等都懒得给顾客打碎，还指望他们“不敢省人工”、“不敢减物力”吗？
“药不到樟树不齐、药不过樟树不灵”。樟树的药灵，灵就灵在加工炮制技艺上。
如今，偷工减料，不按规程炮制的中药店不知凡几。有的不是炮制太过就是物力不及。该挑拣、除杂的不除杂，该去心、皮、核的不去心、皮、核，该切片的不切片。半夏为了制约其所谓棘喉的“毒性”，用水浸泡至内无干心，另取甘草加水煎煮两次，合并煎液，倒入用适量水制成的石灰液中，搅匀，加入上述已浸透的半夏，浸泡，每日搅拌，至剖面黄色均匀，口尝微有麻舌感时，洗净，阴干或烘干，即得。不知经过这样蹂躏的半夏还有什么疗效？白术用土炒或麸炒都可以，但白术因含水量高，炒后焦黄色，断面焦黄。一般一公斤只能炒到0.7公斤左右。药商为了防止炒后减重量，炒得很浅，用焦糖染色，表面焦黄色，断面白色。
制首乌切成小方块的，多为红薯切成丁后加工而成。圆片型的，用大黄加黑豆煮后晒干而成。全蝎价格很贵，炮制用了50%的盐和泥。
更为可恶的“炮制”是那些不法药材经营商，与其说是炮制，倒不说是坑人。姜半夏本来用生姜炮制，有的将半夏放在黄柏水煮成黄色。
据报道，粉萆薢这个品种到目前为止，没有一家中药饮片厂的是正品。敢认真查吗？
造假和炮制是一对帮凶，一丘之貉，这对杀手坑了患者，糟蹋了中医，黑了中国中医学。
3
大面积种植速生药材疗效堪忧
因为国内市场和国外市场的大量需求，野生草本木本药材早已无法满足需要，除极少数属于野外采集，很多药材都是人工栽种。
人工种植在满足了市场需求之外，由于过量使用化肥、农药、激素，以及药材生长环境的改善，导致药效大大降低。
好的药材讲究道地，这样的药材疗效才是上乘的。像大兴安岭的黄芪、终南山的灶心土、云南文山州的三七、武夷山的葛根、九华山的忍冬藤、丹东的龙胆草、绵阳的威灵仙、内蒙古的甘草，长白山的野山参，云南的重楼，武夷山的八角莲，浙江天台的乌药等等。为什么说这些地方出产的药材最好呢？因为这些地方的地理环境、气候环境最适合这些药材生长发育，积蓄能量。
一方水土养一方人，也养一方药材。生长在雪山上的雪莲，生长在东北长白山的人参，寒冷才是最有利于生长的环境条件。如果把它们挪移到温热的地方，即使能够生长也长不出含有哪种疗效的药材，也可能根本无法生长。道理很简单，烟台苹果就要生长在烟台，栽到江南水乡肯定不行，同样南方的橘子栽到黄河以北，长了橘子也不好吃，只能做室内盆景观赏。大棚蔬菜因为没有蔬菜本来生长的季节性，总没有当季的蔬菜味道鲜美浓厚。用化肥、激素“喂”出来的豆芽，就没有农家自己生发的好吃；打了激素的西红柿、黄瓜，如果味道没有什么改变，人家命贵的为啥要吃特供呢？
前不久，一开药店的老板发我一张东北野生人参的照片，说价值1000万元，我说你这个要是值1000万，15年前，我在上海微刻艺术大师黄征和先生家里看到他收藏的那棵朝鲜金日成送给他的野山参要值10个亿。
野山参已经十分罕见，市场上的东北山参绝大多数都是种植的。尽管疗效无法和野山参相比，但是，人参的生长环境基本没有多大改变，疗效还是说的过去。
但是有些药材种植之后，因为“催生”，药效大大降低。1800多年前的医圣张仲景用野生药都是论两论斤，现在老中医用种植药材几克十几克用，疗效怎么会好呢？所以，很多老中医感叹，你的辨证再对用药再准确，如果药材即使不是假的，也治不好或者根本治不了病。
拿附子来说吧。附子最有名的是四川江油市出产的，江油因此被称为“附子之乡”。江油附子药效好是江油这个地方的气候环境最适合附子生长。如果把江油附子引种到海南或者东部省份，那么，江油附子就被“变性”了。现在的江油附子已经不是以前的附子，模样还是那个模样，药效却大打折扣。为什么？因为当地把附子作为一项重要的地方产业来发展，为满足国内外市场的需要，大面积进行人工种植，在种植过程中，由于从气候湿冷的高山上挪到温暖的山下，再加上化肥的作用，让生长缓慢的附子长得飞快，使其心智未能成熟就被采挖。
打个比方，香蕉从树上砍下来的时候是个愣头青，但是经过乙烯利的刺激，到了北方皮就成黄的了，擘开皮以后味道还是可以的。但是，种植的附子和用乙烯利催熟的香蕉不一样，因为种植和采收时间的改变，以及化肥的使用、胆巴的长时间浸泡，本来火性不足的附子“热量”大大减弱。
附子是乌头下面的根，怕热不怕冷，因为耐寒，秋末冬初才开花，移栽后在温度和化肥的作用下，生长很快，6月份就成熟了，附子本来就是个“火娃”更不耐热，如果不赶紧采挖，就会腐烂。本应越冬后的春天采收，变成夏天采收，这样一来，附子的功效全变了。
还有个问题，这样一个弱不禁风的附子，还要接受药水的洗礼。夏天如果不立即进行处理，就会很快烂掉。所以，要用胆巴泡，一斤附子能泡出一斤三两的盐附子，也就是增加了3两盐。想想看，泡那么长时间药性能不受影响吗？然后，盐附子或者胆巴泡的，有的要经过煎、煮、晒、烤，最后白附子还要经过硫磺熏，功效被再一次下降。现在白附片、黑顺片已经没有过去那种麻舌的感觉了。
由此就会想到，为什么四川、云南等地把附子作为冬天的滋补品，熬汤炖肉全家人一块喝，这哪里还是药啊？
做中医的都知道有个“火神派”，“ 火神派”的特点就是善于和敢于用附子。一般用量都是10克以下，而他们100克、200克还不过瘾，有的甚至一副药一次用500克。敢用这么大的量，除了胆识之外，难道与附子不行了没有关系吗？
附子完了。很多和附子一样陷入同样处境的中药材变得“不男不女”。中药需要拯救，拯救先要拯救人心，拯救人心只能靠把法律当作信仰的执法者，否则中药材很有可能变成不值一文的茅草或者杀人于无形的毒草。（本文中部分内容来自网络）
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摘 要 生物监测是环境监测重要部分，当前我国环境监测主要依赖化学分析监测，近年来虽然国际上生物监测技术发展比较迅猛，但基于我国环境监测标准限制，我国生物监测发展一直处于研究阶段，当前生物监测主要依赖于藻、溞和鱼类水生生物物种，对于大型底栖生物目前监测仅依赖于生物多样性调查，因此亟待发展我国水生实验生物，尤其需要加强大型底栖生物生物标志物筛选以及模式化研究。因此本文采用我国广泛分布的软体动物河蚬作为实验生物，为加强其背景生物学研究，系统研究了河蚬生物标志物，最后利用上述标志物探讨了环境污染物对河蚬作用机制。主要研究内容与结果如下：1）利用Illumina技术获得了河蚬miRNA信息转录组信息，获得了28799934条高质量序列，鉴定了45条保守的和39条新的河蚬miRNAs；荧光定量PCR定量结果表明12个miRNA中9个miRNAs在腹足中表达量最高，而miR-10和Novel-2各自在鳃和内脏团中表达最高；预测软件结果发现miRNAs和环境污染相关基因相关，为河蚬作为实验生物提供了分子生物学基础。2）采用RACE技术，成功克隆获得河蚬CCK, Conopression和FFamide的全长 cDNA 序列， 预测了河蚬CCK, Conopression和FFamide蛋白的分子结构特征，并分析了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布；有机磷酸酯对神经肽显著调节，表明了CCK, Conopression和Ffamide适合作为河蚬生物标志物，为环境污染物生物监测提供技术手段。3）结合转录组测序技术和荧光定量PCR技术分析了典型有机磷酸酯（TDCPP和TBP）毒理作用机制，多指标结果表明长期低剂量暴露下，主要影响相关通路为凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路，酶活指标和凋亡相关基因指标证实了典型有机磷酸酯显著诱导河蚬细胞凋亡。关键词：河蚬，miRNA，有机磷酸酯，凋亡通路，生物标志物 ABSTRACT Biological monitoring is an important part of environmental monitoring. Currently the environmental monitoring in China mainly depended on the chemical analysis and monitoring. In recent years, although the internationally biological monitoring technology development is rapid, based on restrictions of our standard of environmental monitoring, the development of biological monitoring in our country has been in the research stage. Currently, biological monitoring manly relies on algae, Daphnia and fish aquatic species, for large benthic current monitoring depends only on biodiversity survey. Therefore, it is urgent to develop aquatic laboratory animals in our country, particularly to strengthen the screening of large benthic biomarkers and modeling study. Therefore in this study the widespread mollusk-Corbicula fluminea in our country was taken as an experimental organism, to strengthen the biological background research, we systematically study biomarkers of the Corbicula fluminea in monitoring environmental pollutants. Finally, we discuss mechanism of environmental pollutants on Corbicula fluminea through the above markers. The main research contents and results are as follows: 1) Through Illumina sequencing we obtained the Corbicula fluminea miRNA biological information, and obtained the 28799934 high quality sequences, then identified 45 conservative and 39 new Corbicula fluminea miRNAs; Fluorescence quantitative PCR results showed that nine miRNAs of 12 were expressed highest in the gastropod, while miR-10 and Novel-2 was expressed highest respectively in gill and visceral mass; Software prediction results showed that miRNAs related to environmental pollution genes, this provides a molecular biological basis for Corbicula fluminea as an experimental organism. 2) Through RACE technology, we successfully cloned the Corbicula fluminea the full-length cDNA sequence of CCK, Conopression and FFamide, predicted the molecular structure of Corbicula fluminea CCK, Conopression and FFamide protein, and analyzed the distribution of neuropeptide expression in different tissues of Corbicula fluminea; the organic phosphate significantly increased the expression of neuropeptide, indicating that the CCK, and Ffamide Conopression can be taken as Corbicula fluminea biomarkers and this provides a technical means for the biological monitoring of environmental pollutants. 3) By combining with transcriptome sequencing technology and fluorescence quantitative PCR we analysis the toxicological mechanism of typical organic phosphate(TDCPP and TBP), Multiple indicators showed that long-term low-dose exposure mainly effect apoptosis pathway, focal adhesion pathway, small cell lung cancer pathway and cell adhesion molecular pathways, the detect of caspase enzyme activity and apoptosis related genes confirmed that typical organic phosphate significantly induced Corbicula fluminea cell apoptosis. Key Words: Corbicula fluminea, miRNA, organophosphates, apoptotic pathways, biomarkers 1.1 生物标志物应用现状 随着人类工业化进程的增加，环境中的污染物越来越多，对人和动植物的健康造成了潜在威胁，大量研究表明，水体中的污染物随着营养能级的提高，难降解、高亲脂性的污染物成百上千倍的在生物体中累积[1, 2]，而作为营养级最高的人类，自然会遭受很大的环境风险，而常规的化学法监测效率低，成本高，监测品种少，难以满足快速增长的污染物品种，因此使用生物作为监测工具，开发相关的生物标志物，对解决当前多门类的环境污染物评估具有重要意义[3, 4]。Goksoyr 等[4]首先定义了生物标志物是生物体暴露在亚致死剂量的环境污染物时，在分子、细胞等水平上发生异常变化的生理生化指标。这些指标通常是生物体早期损伤的预警，开发出相应生物标志物就能为此类环境污染物提供风险评估[5]。水生生物能实时监测水质情况，比传统化学法更加具有优势。我国科学家已经开发出了基于稀有鮈鲫的实时在线监测系统，目前已经广泛的应用到我国水源地监测水质情况，为我们使用安全的饮用水提供了预警，运用了稀有鮈鲫对污染物的敏感特点。汪纪仓等[6]研究了在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的氧化应激作用，发现醋酸镉通过ROS导致肝细胞凋亡并导致氧化损伤，不是通过caspase途径，ROS才是镉的生物标志物。熊力等[7] 研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸作用和毒性效应，发现p53基因和CYP1A基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作用的生物标志物。陈辉辉等[8]使用河蚬为受试生物，开发出了氟西汀的相关生物标志物，发现河蚬在氟西汀暴露下，ATP结合转运蛋白基因受到抑制，而且超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛酶活性升高，指示了氟西汀的效应。Cooper等[9]将河蚬暴露在不同浓度毒死蜱下，发现乙酰胆碱酯酶活性是毒死蜱的生物标志物，其活性在高浓度受到明显抑制。相比较而言，河蚬等底栖生物的研究比较少，相关研究也主要是常规标志物，但底栖生物能直接反应水体污染现状，开发我国淡水底栖生物的神经肽类生物标志物并将其运用到环境评价，监测上去具有十分重大的意义。1.2 microRNA与生物标志物 1.2.1 microRNA背景介绍 MicroRNAs (miRNAs) 是内源性的小无编码RNAs（典型的19到23个核苷酸），通过在转录或后转录水平剪切或抑制翻译动植物mRNAs来调控基因的表达[10]。自从第一个miRNA（lin-4）在线虫中发现以来[11]，大量的miRNAs通过克隆和小RNA测序在不同的物种中被发现[12-16]。目前大约有28645个成熟体miRNAs在223个物种中鉴定出来[17]，人类中发现的miRNAs最多达到1881个前体[18]。在硬骨鱼中总共有1637个成熟体被发现[17]。在软体动物中仅仅发现69个miRNAs[17]，此外，在珍珠贝中发现258个[19]，在牡蛎中发现199个[20]，然而淡水软体动物（如河蚬）还没有miRNAs的相关报道。近期研究表明miRNAs与器官发育，细胞分化，细胞凋亡有关[21-24].55个miRNAs在牡蛎中被发现可能调控免疫反应[25, 26]。此外。37个栉孔扇贝miRNAs能应答AVNV感染[27]。而且，厚壳玉黍螺胰腺中的miR-29b和腹足中的miR-2a能在自然结冰或缺氧条件下应答[28]。Jiao等[29]通过计算预测方法预测了珍珠贝候选的miRNAs和它们在生物矿化作用中的潜在功能。尽管有计算方法报道过软体动物miRNAs的功能，但淡水软体动物的还不清楚。Solexa测序是一种测短片段序列的技术[30]，目前已经广泛的在不同物种中用来鉴定保守的和新的miRNAs[31-33]。与传统的miRNAs鉴定方法（计算预测和直接克隆）相比，Solexa测序可以用来发现保守的和低丰度非保守的miRNAs，甚至在没有基因组数据的情况下[34]。1.2.2 microRNA生物标志物 毒理学研究表明,在环境污染物影响下,生物体相关miRNA表达会发生变化,相应的其靶基因表达也会发生改变。因此在环境毒理学研究中，miRNA可作为识别环境中污染物的生物标记物。王法琦等[35] 使用miRNA芯片技术研究了PFOS暴露下，出生一天和七天大鼠脑组织miRNA表达的变化，结果表明PFOS暴露下出生一天和七天的大鼠脑组织分别有24和17个miRNA表达量发生了显著性差异。通过分析得出PFOS暴露可能对大鼠子代大脑学习记忆能力造成威胁，并且miR-207、miR-297、miR-466b、miR-672和miR-674-3p可能在调控中发挥作用。李鹿丰等[36]研究了在氟虫腈作用下异位表达的miR-155对斑马鱼胚胎细胞ZF4存活的影响，结果表明，72h氟虫腈暴露下，瞬时转染miR-155可以显著降低ZF4细胞的存活率，其潜在靶基因cyb561d2表达显著降低。得出miR-155可作为氟虫腈环境毒性的潜在的生物标志物。Malik等[37]研究了不同剂量苯并芘28天暴露后小鼠肝脏mRNA和miR-34a表达的变化，结果表明50和75 mg/kg/day BaP暴露后miR-34a表达量相对于空白组分别显著性升高了2被和3.6倍，而其他miRNA没有观察到显著性变化，这个miRNA是与P53应答相关联。目前关于miRNA的毒理学研究主要集中在哺乳动物，而水生动物特别是底栖动物没有相关研究，miRNA背景学资料相当缺乏，底栖生物能直接反应水体污染，其miRNA毒理学研究没有报道，急需进行相关研究。1.3 转录组测序技术与生物标志物 1.3.1 转录组学概述 转录组是特定发展阶段或生理条件下一个细胞中所有转录本的总和，转录组对了解基因组的功能，揭露细胞和组织的分子成分，了解发育与疾病具有重要意义。转录组学到重要目的在于：记录物种的所有转录本，包括mRNAs，非编码RNAs和小RNAs；决定基因的起始位点，5’和3’转录结构，剪切类型，其他转录后的变化；量化每个转录本在发育或其他不同条件下的表达改变水平。对于非模式生物，因为缺乏相关基因组信息，其遗传育种，生命特征等研究进展缓慢，传统的cDNA克隆，基因芯片技术耗时长，效率低，已经无法满足高速发展的生物信息学技术。1.3.2 转录组测序技术 随着测序技术的发展，第二代测序技术成为很好解决非模式生物基因信息学的一个工具，与传统基因芯片，克隆技术相比，不用知晓基因片段信息。转录组测序技术检测转录本的精确度达到单核核苷酸水平，不仅可以分析基因表达水平和转录本的序列，而且能检测稀有转录本和未知序列，提供丰富的转录组信息，为我们认识真核生物转录组信息提供了快速，高效，精确的测序技术。目前，已有人类细胞[38]，老鼠[39]，斑马鱼[40]，河蚬[41]，拟南芥[42]，啤酒酵母[43]进行了转录组测序和分析，为在基因水平研究这些物种提供了生物信息学基础。目前，二代测序平台主要有三个，如ABI公司的(AB SOLiD)、Illumina 公司(Genome Analyzer II) 和Roche 公司(454 GS-FLX)，后来，单分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术由Helicos Biosciences 公司推出。一个重要特点就是高通量，数以千万计的reads被测序。下表列举了这三个平台的异同点。表1-1 几种测序平台优缺点 测序平台 Illumina/Solexa GA IIx ABI/SOLiD SOLiD3 Roche/454 GS FLX Helicos HeliScope 测序原理 可逆染料终 结合成测序 连接测序 焦磷酸合成 测序 单分子合成 测序 平均读长(bp) 100 35 400～700 21~35 运行时间(d/run) 3~10 7 0.5 5 美元/Mb碱基 0.05 0.15 15 1 主要错误类型 替换 替换 缺失与插入 缺失 准确率 ≧98.5% ≧99.94% ≧99.9% ≧99% 优点 性价比高 准确率最高 运行速度快，读长最长 产量高 缺点 读长短 运行时间长，读长短 错误率高，性价比低 错误率高 本论文以Illumina公司的Hiseq2000测序平台为例，转录组测序技术测序流程主要包括[44, 45]：1、RNA样品准备与质量控制；2、mRNA的纯化与片段化；3、cDNA文库第一链的合成；4、cDNA文库第二链的合成；5、末端修复与加A；6、PCR扩增；7、琼脂糖凝胶的纯化；8、cDNA库的质量控制；9、簇生成；10、上机测序并分析。流程图如下：图1-1 Illumina Hiseq2000测序平台流程图 转录组测序结果数据量巨大，往往需要使用专业的生物信息学分析，对测序得到的原始 reads（双端序列）进行质量评估和过滤后，将高质量的 reads 进行转录本的组装，对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 回帖到参考序列上，再基于回帖结果进行表达量分析、差异表达基因功能注释等高级分析。一般主流的比对数据库有：美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information, NCBI），欧洲生物信息学研究所（European Bioinformatics Institute, EMBI），COG（Clusters of Orthologous Groups）蛋白数据库，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes database）数据库。数据分析流程图如下：图1-2 测序数据分析流程图 1.3.3 转录组测序技术在环境毒理学上的应用 目前在环境毒理学上转录组测序技术有两个方面的主要作用：分子标记物的筛选与鉴定；环境中不同污染物对水生生物的毒理学效应和机制。Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露后的青鳉转录组数据，发现青鳉蛋白和脂肪代谢，线粒体功能和神经系统等通路受到了影响；陈辉辉等[41]在2013年报道了氟西汀暴露后河蚬的转录组数据分析结果，鉴定了9383个差异转录本，发现氟西汀的主要影响河蚬的ABC跨膜蛋白，谷胱甘肽代谢，类固醇合成代谢和细胞自噬作用的通路。总之，转录组测序技术在环境毒理学研究中具有很大优势，不仅可以获取受试生物高通量生物学信息，还能鉴定差异转录本，深入研究环境污染物的毒性效应和机制。1.4神经肽与生物标志物 1.4.1 神经肽定义，分类与功能 神经肽是一系列不同类的细胞信号分子，由神经元细胞通过调控分泌通路产生和释放[47]。它们在功能上起到神经激素，神经递质和神经调质的作用。作为神经活动的调质，神经肽将神经信号在上下游神经元细胞间传递[48]。神经肽还可以作为激素经由神经器官的网络释放到血淋巴中在调节各种生理状态，包括生长、代谢和繁殖[49]，例如脑啡肽作为神经递质在脑参与外围活动包括免疫细胞功能的调节[50, 51]。第一个神经肽P物质是在上个世纪早期发现，首先从马的大脑和肠道中粗略的提取出来，并且发现它具有强力的降血压和缓解肌肉收缩的作用[52, 53]。对神经肽严肃而专注的研究已经超过30年，大量的神经肽和它们的家族已经在脊椎和无脊椎动物中鉴定出来，如人，老鼠，猪和章鱼，这些研究对理解它们的功能和特征起到了很大的作用[54]。目前神经肽按家族可以分为：速激肽、下丘脑神经肽、垂体后叶激素、内阿片肽、高血糖素相关肽、神经肽Y记忆家族、内皮素家族、心房肽家族以及铃蟾样肽家族[55]。在无脊椎生物中，许多神经肽也被发掘出来，有抗菌肽、阿片肽、缩胆囊肽等十几个肽家族[47]，而且目前还在不断扩充中，在功能上起到控制生殖，摄食，肌肉收缩，免疫等[50, 56-58]作用。例如FMRF神经肽作为在海蜗牛中发现的最著名的，起到生理上控制鳃的作用[59]，而且通过免疫组化定位与高效液相色谱法发现在心脏组织中存在[60]。在基因组数据的挖掘和神经系统组织肽分析的帮助下，牡蛎的神经肽研究得到了极大提升[61]。肠促胰酶肽（Cholecystokinin (CCK)）首先被Mutt和Jorpes于1968年发现并命名[62].在脊椎动物中，CCK广泛的分布于脑，据文献报道能减少鸟类，啮齿类动物，猪，羊，非人类灵长类动物以及人的食物摄入[47]。通过调控饱腹感中心来达到调控进食的作用[63, 64]。在软体动物在，CCK可能与一些综合感官功能有关，例如进食相关的行为，在感觉和神经激素间的通信[65-68]. 文献HgCl2可以促进CCK的免疫荧光反应[69, 70]。Conopressin神经肽，首先在锥形蜗牛的毒液中发现[71]，随后在其他几个无脊椎动物中冶发现，例如牡蛎和蜗牛[56, 72]。文献报道Conopressin与静水椎实螺雄性的交配行为调控有关，在交配期间通过刺激输精管中平滑肌自发性收缩最终导致精子的喷射[73]. 神经肽FF 1985年从牛的大脑中分离出来[74]，是Rfamide肽家族的一员 [57]，而这个神经肽的生物学功能包括痛觉调控，食物摄取，胃肠道和激素的调控，阿片类药物耐受与成瘾和心血管行为的调控[58, 75, 76]。而在软体动物中，文献报道于1995年从静水椎实螺获取FF神经肽的结构是GLTPNMNSLFF-amide，并且该神经肽调控输精管中精子的转移速率[77]。1.4.1神经肽标志物 Lodhe[70]等使用HgCl2和ZnCl2暴露淡水螺后发现，HgCl2的毒理效应比ZnCl2更加与CCK的行为和免疫反应有关。进一步的实验表明HgCl2能使神经元中粘蛋白含量上升和CCK免疫反应增强，并随着时间推移越来越强[69]。MacDonald[78]等通过给眼斑鳐2周饥饿处理，发现端脑的NPY和肠道中的CCK神经肽基因表达水平升高，但是下丘脑中NPY和CCK表达水平没有受到影响，总之，神经肽在环境毒理学上的应用也非常少，环境污染物对神经肽的干扰效应也未知。淡水双壳软体动物（例如河蚬）的神经肽研究目前也没有报道，急需进行生物标志物的开发。1.5 有机磷酸酯 1.5.1 有机磷酸酯介绍 自从一些溴代阻燃剂被禁用以来，有机磷酸酯(organophosphorus flame retardants，OPFRs)阻燃剂因其具有良好的阻燃特性，产量大，具有可塑性，易生产，而被广泛的使用，如电子、装饰，化工，纺织等行业，因其是直接混入材料中，有机磷酸酯极易释放到外界环境中，从大气，水体，土地，生物体内都监测到有机磷酸酯的存在，而相关研究表明，有机磷酸酯性质稳定，难以降解，具有环境持久性，毒理学研究表明OPFRs具有明显的致癌性，基因毒性和神经毒性，并能刺激人的皮肤[79-83]。Wang[84]等使用10, 50, 100, 300和600 μg/L TDCPP暴露斑马鱼胚胎，发现暴露引起了体重的减少，孵化率，存活率和心跳速率降低，增加了畸形率，进一步的分子实验表明TDCPP能显著性降低甲状腺激素水平，而增加整体甲腺原氨酸水平，引起了甲状腺内分泌干扰效应。Liu[85]等将斑马鱼暴露在TDCPP和TPP 21天后发现成鱼体中17β雌二醇，卵黄蛋白原水平显著上升，相关的CYP11A，CYP17，GnRH基因表达量都发生改变，得出TDCPP和TPP通过改变下丘脑-垂体-性腺轴调控机制而干扰性激素的平衡，最终达到干扰斑马鱼生殖行为。有机磷酸酯在结构上类似有神经毒性的有机磷农药[86]，而在人居环境中大量存在有机磷酸酯，对人体健康有着潜在的危害。Dishaw[86]等通过在几种典型有机磷酸酯中暴露PC12细胞发现这些OPFRs比四溴联苯醚具有更强的神经毒性。Meeker[87]等初步研究表明有机磷酸酯能影响人激素水平并降低精子活性。1.5.2 四种有机磷酸酯 磷酸三(2,3-二氯丙基)酯（tris(2,3-dichloropropyl) phosphate，TDCPP），使用量最广泛的有机磷酸酯阻燃剂，据报道在美国TDCPP从1998年的年产量4500吨快速增加到2006年的22700吨[88]，环境中频繁的检测到了TDCPP的存在，如室内空气，灰尘，地表水，饮用水，河流，污水，沉积物和生物群体[88]。例如在地表水，报道TDCPP达到50 ng/L[89]，而更高浓度的TDCPP在德国和挪威的污水处理厂出水中监测到，从20 ng/L到740 ng/L不等[88-90]。而在生物体中，发现TDCPP在鲈鱼体中达到36–140 g/kg脂肪重量[91]。在中国的松花江和太湖的沉积物中都检测到了TDCPP，浓度分分别是2.5-40 ng/L和0.62-5.54 g/kg[92, 93]。而目前关于TDCPP的毒理学机制相关文献报道非常有限。急性毒性结果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更强，虹鳟96小时半致死浓度是1.1 mg/L[94]，而斑马鱼胚胎116小时半致死浓度是7.0 mg/L[81]。磷酸三丁酯（Tributyl phosphate，TBP），广泛在核处理，化学工业，防火材料中使用的有机磷酸酯[95, 96]，据报道引起了工人的恶心和头痛[97]，环境中广泛存在，甚至在人血液和牛奶中也有检测到[98, 99]。而在海洋底部以从底泥和碎屑中觅食的底栖生物体内，发现肠道和肉中TBP最高含量分别为230 ng/g湿重和12 ng/g湿重[100]。但是目前人们对TBP的毒理认识还不足。磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris-(2-chloroethyl)-phosphate，TCEP）是一种典型的OPFRs，目前已经被列为痕量污染物名录[101]，在世界范围内广泛的用于液体不饱和聚酯树脂的合成，纺织品背面涂层，PVC，纤维素酯化合物以及涂料[94]。TCEP曾经在1998年产量高达9000吨，但在1997年降至4000吨[101]。然而，TCEP作为一个典型的痕量污染物因为很低的去除率[102, 103]，目前在地表水，污水处理厂出水，海洋和饮用水中浓度从ng/L到μg/L[89, 104]。对TCEP的毒理学研究已经在神经毒性，致畸性，致癌性上有所发现[105-108]。因此环境浓度的TCEP的潜在影响绝大多数还不清楚。磷酸三（丁氧基乙基）酯（tris(2-butoxyethyl)phosphate, TBEP）也是一种广泛使用的OPFRs，Meyer[102]等通过检测德国某污水厂出水发现TBEP含量为 2400-6100ng/L，每年全世界的产量为5000到6000吨[94]。Sager[109]等发现TBEP可能结合β肾上腺素转运蛋白而影响β肾上腺素信号系统的生物学过程。目前对TBEP的毒理学研究非常少。1.6河蚬的生物学背景及其在环境毒理学研究上的应用 1.6.1 河蚬的生物学背景 河蚬俗称黄蚬、沙喇、沙螺、蟟仔、蝲仔拉丁名（Corbicula fluminea），一种双壳贝类，原产于我国、日本、朝鲜、东南亚各国[110, 111]，隶属软体动物门，瓣鳃纲（Lamellibranchis），真瓣鳃目（Eulamellibranchia），蚬科（Corbiculidae），蚬属（Corbicula）。是我国重要的淡水经济贝类之一，在20世纪初由移民传入欧洲和北美，由于当地淡水环境很适合河蚬生长繁殖，且河蚬因其有双壳严密保护，环境适应能力极强，在当地的河流，湖泊，湿地大量繁殖，已经被欧洲和北美列为外来入侵物种[112-114]。河蚬喜欢穴居，以水底泥，沙作为理想栖息环境，因生活的底泥颜色差异而形成黄色和黑色，壳硬且厚，长约1.5～2.8cm，呈圆底三角形，壳顶部向外膨胀，壳面泛有紫色光泽，具有类似同心圆的生长轮脉，适宜生长水温为9-32℃[115]，以水中有机碎屑，浮游生物等为食，食性杂，通过鳃滤食食物[116]，是一种底栖生物，目前，在我国淮河，黄河，长江，江苏洪泽湖，洞庭湖等淡水水域，河蚬大量分布，在江浙，广东和福建等地，河蚬被大量养殖。河蚬不仅味道十分鲜美，营养价值很高，而且蚬肉可入药，能明目，通乳，利尿，开胃和解救，对心脏病，肝病，高血压具有显著效果[115, 117]，具有极高的经济价值和药用价值，在海内外特别是韩国日本市场很热销。1.6.2 河蚬在环境毒理学上的应用 双壳软体动物因其长期生活在水中，活动能力缓慢，捕捞方便，接触水底底泥并对水中污染物具有很强的富集作用，是很理想的水体污染指示生物，一直是环境毒理学研究的实验生物[118-120]，目前以牡蛎，紫贻贝，菲律宾蛤等海洋贝类在环境毒理学中的研究比较多[79, 121, 122]，而淡水贝类特别是我国河蚬的环境毒理应用研究报道比较少。河蚬在我国以及世界淡水环境中分布非常广泛，当前对其的研究主要是繁殖、形态、营养学和少量毒理相关研究。河蚬作为我国本土淡水双壳贝类，是很好的环境毒理学指示性生物[123]。在我国淡水水域分布极为广泛，数量丰富，容易捕捞，与底泥长期直接接触，可以很直接的反应我国各水体污染状况，而且已经建立实验室驯养和暴露测试体系[8]。先前的研究已经报道过河蚬对水中污染物的高度敏感性[124, 125]。目前，国内外对河蚬在环境毒理学上的研究主要有以下3个方向：1）河蚬对水体污染物的生物富集效应，Arini[126]等研究了河蚬暴露在Cd，Zn后的回复能力，结果表明一年后仅仅73%的Cd被从河蚬体中排出，而Zn很快就被净化掉。Mark[127]等研究了纺织厂下游河流里河蚬体中的污染物富集情况，发现河蚬体中α-和β-HBCD比沉积物中高。李天云[125]等研究了河蚬对天津排污河道多环芳烃和有机氯农药的富集效应，发现河蚬对有机氯农药的生物-沉积物富集因子为1.79±0.22，而对多环芳烃的富集因子范围是0.021-0.147。以上报道显示了河蚬具有较强的有机物和重金属的生物富集效应。2）对水环境的实时生物监测，目前研究表明河蚬在水体环境恶化时会关闭双壳形成密闭空间来保护自己[128]，这种闭壳保护系统已经运用到污染物的生物监测上，Damien[129]等研究了Cd与河蚬闭壳效应的关系，并在壳上安装电极来实时监测污染状况，Damien[130]等研究河蚬对Cu的闭壳应答关系。3）水中污染物的毒理学研究，国内外研究主要集中在环境污染物对河蚬的毒理效应和毒理机制，评价污染物有微囊藻毒素，有机污染物，内分泌干扰物，重金属，个人护理用品等[8, 9, 131-134]。陈辉辉[123]等研究了卡马西平对河蚬的毒理学机制，发现5和50 μg/L卡马西平暴露后，河蚬Hsp22，Hsp27，Hsp40，Hsp70和Hsp90基因表达量显著性上调，而Hsp60基因表达受到抑制。Aurélie[133]等研究了河蚬对Cu和Cd的早期应答反应，结果表明消化腺中金属硫蛋白基因显著上调，而SOD，CAT，SeGPx和p-GST表达水平降低。以上研究报道为我们研究水中污染物对河蚬的毒理学效应和机制提供了理论基础和科学依据。图 1-1 常见双壳类的内部结构示意图（图示为中国蛤蜊） 1.7 实验的目的和意义 目前，国内外已经研究神经肽30多年，在人，老鼠上研究的比较成熟，而在无脊椎动物中的研究也是一直关注的重点，但是大多集中在海洋软体动物和陆生无脊椎动物，没有淡水双壳贝类的相关研究，且环境污染物对神经肽的研究报道非常少。近年来随着溴代阻燃剂的禁用，有机磷酸酯作为一种新型阻燃剂被应用到生活生产的方方面面，而相关文献报道OPFRs对人类健康有潜在的风险，人们对OPFRs的关注度也越来越高，但是对OPFRs的毒理学研究还非常少，对OPFRs的危害评估体系尚不健全。急需建立生态安全评估体系。在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。图1-1 本论文的技术路线? 第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green; TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列被比对到数据库。属于35个miRNAs家族的45个保守的miRNAs被鉴定出来（附录4）。此外，这些结果显示有26个保守的miRNAs超过1000测序数。miR-10测得1304866个拷贝数，是最多的，紧接着是miR-184（258355），miR-315（220094）和miR-7（144322）（附录2）。在这些保守的miRNAs中，15个只有低于100个拷贝数。miR-67a和miR-67b只被检测到1次。2.3.3 河蚬新miRNAs的鉴定 因为河蚬基因组信息未知，所以我们使用牡蛎基因组和河蚬EST数据库用来预测新miRNAs[153]。44个符合规则的小RNAs被认为是潜在的新miRNAs。它们二级结构的自由能从?20.10到?99.00 kcal/mol（附录3）。有28个新miRNAs被检测少于100个拷贝，15个新miRNAs少于10个拷贝。预测的5个表达最高的miRNAs的二级结构如图2-2。图 2-2 5个表达最高的新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布，我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地，4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)（图2-3）miRNAs被检测了表达水平。结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高，然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外，miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言，一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高，接着是外套膜，鳃和内脏团。此外，我们发现miR-12主要在腹足中表达，然后依次是内脏团，鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且，miR-184和miR-10表达水平在鳃，腹足和外套膜中几乎一样，在内脏团中明显低。而在新miRNAs中，Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富，在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高，接着是外套膜和鳃，而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达，但在腹足外套膜和内脏团中表达高。图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中（鳃，腹足，内脏团，外套膜）的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能，我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件，这款软件允许G=U假阳性，这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人，老鼠，苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言，RNAhybrid是一款简单，快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点，能计算杂交结构自由能。结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用（表2-3），metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992，miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据，并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达，文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158]，David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达，能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达，接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达，仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。河蚬新miRNAs的表达量低， 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29]，此外，25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000，绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。2.5 本章小结 在本研究中，我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs，发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言 目前，人，老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟，无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛，牡蛎，章鱼等海洋软体动物，没有淡水双壳类动物的文献报道，神经肽的毒理学研究也很少，开发河蚬典型神经肽标志物，并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考，运用RACE技术，成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长，对全长序列进行了生物信息学分析，使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布，并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响，筛查了神经肽标志物。3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA）公司；荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT） 18、DNase I和dNTP购自Promega（USA）公司；100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生物（北京，中国）公司；SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA）公司；TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China）公司；三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA） PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA） Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA） 梯度热循环仪（Veriti thermal cycle system）（Life Technologies，USA） Multiskan GO 酶标仪（Thermo Scientific，USA） 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system（Life Technologies，USA） 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件，Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖，在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集，壳长在1-3cm 左右，年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖，建立一套恒温的流水系统进行养殖，选用水泥池流水循环系统养殖河蚬，以水泵提供流水动力，建有过滤池和养殖池，水经过水泵从过滤池传送到养殖池，再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙，所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水，室内温度使用空调控制，水温保持在20±1oC，水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h：12h，饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻，或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见附录1。3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤：河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法，在无菌和无RNA酶的超净工作台进行，具体操作步骤如下：(1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管，迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液，然后用电动棒碾磨均匀，接着加入冰预冷的800μL Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%，室温放置5min，使其充分裂解。(2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒，室温放置3 min，然后放入离心机，4℃，12000转，离心15min，吸取上层水相，尽量不要将沉淀吸入，移至另一1.5mLEP管中。(3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀，室温放置10min。(4)12000 g，4°C，离心10 min，弃上清，此时RNA沉于管底。(5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。(6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。(7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。（3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。（4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promega的M-MLV反转录系统。主要步骤如下：（1）在一支无核酸酶污染的小离心管中加入2μg总RNA，2μg随机引物和去离子水一共15μL，在金属浴中加热离心管到70℃，5min，这样可以打开模板的二级结构。然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构，短暂离心，使溶液归于管底；（2）按照下列表格的顺序和比例在上个步骤的离心管中加入反应体系的各个组分：M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液 1.25μL Rnasin核酸酶抑制剂25Units 0.75μL M-MLV Reverse Transcriptase 200U 1μL 无核酸水 2μL Total volume 25μL 轻弹或短暂离心混合溶液。37℃孵育60min进行反转录反应，然后在-20℃保存。3.2.3.4. 3′和 5′RACE cDNA模板的合成 利用 SMART TM RACE Amplification Kit (Clontech）合成 RACE 模板。（1）Buffer Mix 5×First-stand Buffer 4μL DTT(100mm） 0.5μL dNTP Mix(20mm） 1.0μL Total volume 5.5μL （2）5′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 5′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 8μL （3）3′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 3′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 9μL （4）（2）和（3）两离心管中的混合物分别混匀，短暂离心。（5）72°C 下加热3min，然后42°C 下保温2min；在冰中冷却2min后 14000g离心10s。（6）向5′RACE cDNA中加入1μL SMARTerⅡA oligonucleotide，轻微振荡后短暂离心。（7）室温下混合以下试剂：Buffer Mix 5.5μL RNase inhibitor 0.5μL SMART Scribe Rererse Trancriptate(100U） 2μL Total volume 8μL （8）向上述混合液中分别加入（6）中的 5′RACE cDNA 和（3）中 3′RACE cDNA，终体积为 20μL。（9）轻微振动离心管瞬时离心，42°C孵化90min，之后于 72°C下保温 10min。（10）加入90μL Tricine-EDTA Buffer对RACE cDNA库进行稀释，cDNA库在-20°C可保存三个月，或在-80°C长期保存。3.2.4河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.2.4.1 3'RACE和5'RACE cDNA 扩增 根据本实验室转录组测序所得的CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因序列片段, 设计3'和5'RACE 特异性引物，引物设计采用 Primer Premier 5.0 软件进行， 所设计的引物由上海生工生物公司合成（表4-1）。表3-1 基因克隆与荧光定量 PCR 所用引物序列 Primer name Primer sequence (5’→3’） Application CCK-F GAACAAGCAGAATGACGG qPCR CCK-R ACTCTTCGCCCTTTTACC Conopressin-F TCACTACATCGGTGACTATAA Conopressin-R ATGTTCAGAGTTCATATTGGG FFamide-F TACCGCTATCGCAATCTT FFamide-R GAAAAGGTTTAAGACATCA UPM CTAATP管中，加入200μL裂、神经肽标志物的开发还处于起步阶段，完善的标志物评估体系需要进一步建立起来；3、目前的研究仅以成年河蚬为受试对象，以后需要建立针对河蚬受精卵、幼蚬的毒性测试方法。
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